2) الايزاي غير مستقيم (INDIRESITI ELISA)

اين روش براي تعيين آنتي‏ بادي اختصاصي و يا تيتراسيون آنتي‏ بادي در نمونه‏ هاي سرم مورد استفاده قرار مي‏گيرد. اساس آزمايش بدين نحو است كه معمولا سرم رقيق شده به آنتي ژن‏هاي كوت شده در فاز جامد (ميكرو ول يا چاهك) اضافه مي‏شود. آنتي ‏ژن كوت شده آنتي ‏ژن اختصاصي مربوط به آنتي ‏بادي است كه قرار است در نمونه رديابي شود. پس از افزودن نمونه و طي زمان انكوباسيون و يك مرحله شستشو آنتي‏ هيومن گلوبولين نشاندار شده با آنزيم به چاهك اضافه مي‏شود. بر حسب اينكه چه كلاسي از آنتي‏ بادي براي رديابي اهميت دارد نوع آنتي Ig مورد استفاده نيز متفاوت است مثلا براي رديابي آنتي‏ بادي كلاس IgG از آنتي‏ هيومن IgG و براي رديابي كلاس IgA از آنتي‏ هيومن IgA استفاده مي‏شود.
اختصاصيت سنجش مستقيما توسط آنتي ‏ژن كوت شده در فاز جامد تعيين مي‏شود كه ممكن است كاملا خالص و اختصاصي باشد و يا نسبتا خام و غيراختصاصي باشد. سرم حاوي آنتي‏ بادي اختصاصي مي‏تواند در يك بافر براي جلوگيري از جذب غيراختصاصي پروتئين‏ها و جلوگيري از اشغال نقاط اتصال آنتي ‏ژن رقيق شود. به چنين بافري محلول رقيق‏ كننده نمونه (sample diluent) گفته مي‏شود. حساسيت و ويژگي چنين روشهايي مي‏تواند با بكارگيري روش Antibody capture با كاهش تداخل اثر آنتي‏ بادي غيراختصاصي بهتر شود.

بهترين مثالها در مورد اين روش تعيين آنتي‏ بادي بر عليه توكسوپلاسما، روبلا، ويروس سيتومگال و هليكوباكترپيلوري از كلاسهاي IgM و IgA و IgG در سرم مي‏باشد. البته امروزه براي تعيين IgM بر عليه اين عوامل عموما از روش capture استفاده مي‏شود در روش capture آنتي ‏بادي‏هاي موجود در نمونه از كلاس IgM به روي چاهكهاي كد شده با آنتي‏ هيومن IgM جذب شده و سپس براي تشخيص، از آنتي ‏ژن اختصاصي مربوطه كه آنزيم نشاندار شده است و يا آنتي ‏بادي نشاندار ضد آن به صورت مزدوج استفاده مي‏شود.

۳) الايزاي ساندويچ

روش ساندويچ الايزا خود به 2 دسته تقسيم مي‏شود:

الف) روش Ag capture يا Ab sandwich: در اين روش يك آنتي‏ ژن در بين 2 آنتي بادي اختصاصي قرار مي‏گيرد اين روش شايعترين روش الايزا محسوب مي‏شود در اين روش از يك آنتي‏ بادي براي به دام انداختن آنتي‏ ژن بر روي چاهكهاي الايزا استفاده مي‏شود و آنتي‏ بادي دوم كه با آنزيم نشاندار شده است به عنوان شناساگر عمل مي‏كند. قابل ذكر است كه در اين روش آنتي‏ ژن بايد حداقل داراي 2 ناحيه‏ ي آنتي‏ ژنيك متفاوت باشد تا قادر به اتصال هر 2 آنتي‏ بادي باشد مثالهاي بارز اين روش اندازه‏ گيري PSA ،FSH ،LH ،TSH ،HCG و... است.

 

ب) روش Antibody capture

۱- Ag sandwich or direct Ab capture: اين روش براي تعيين سنجش آنتي‏ بادي مورد استفاده قرار مي‏گيرد. بدين صورت كه از يك آنتي‏ ژن كوت شده بر روي فاز جامد براي به دام انداختن آنتي‏ بادي اختصاصي آن استفاده مي‏شود و همان آنتي‏ بادي از طريق بازوي ديگر خود (Fab) پذيراي همان آنتي ‏ژن اما به صورت نشاندار مي‏باشد در نتيجه آنتي‏ بادي اختصاصي در بين ۲ آنتي ژن ساندويچ مي‏گردد. در اين روش آنتي‏ بادي توتال از هر كلاس ايمونوگلوبولين ميسر است و يكي از اختصاصي‏ ترين و حساس‏ ترين روشها براي تشخيص آنتي‏ بادي در نمونه است مثال بارز اين روش كيت اندازه ‏گيري آنتي‏ بادي بر عليه پلاسموديوم ويواكس، ترپونما پاليدوم و HBs Ab مي‏باشد.

۲- Indirect Ag Sandwich or Indirect Ab capture: در اين روش پس از به دام انداختن آنتي ‏بادي توسط آنتي‏ هيومن گلوبولين كوت شده در كف چاهكها با اضافه كردن آنتي‏ ژن اختصاصي و تشكيل كمپلكس از يك آنتي‏ بادي اختصاصي نشاندار بر عليه آنتي‏ ژن به عنوان سيستم شناساگر استفاده مي‏شود.

 

4)الايزاي رقابتي يا مهاري

در روشهاي رقابتي اساس سنجش بر رقابت دو آنتي ‏ژن يا دو آنتي‏ بادي ( كه يكي از آن دو نشاندار است) براي اتصال به ليگاند با مقدار محدود استوار است. اگر هر دو آناليت نشاندار و غيرنشاندار با هم به سيستم اضافه شوند روش را رقابتي مي‏نامند ولي چنانچه ابتدا آناليت اضافه شده و پس از يك دوره انكوباسيون آناليت نشاندار اضافه گردد روش را مهاري يا بلوكينگ مي‏نامند. در روش مهاري ممكن است در بين 2 مرحله و قبل از اضافه نمودن آناليت بعدي شستشو انجام شود يا انجام نشود مثال بارز روشهاي رقابتي و مهارتي سنجش T3 ،T4 مي‏باشد. انواع روشهاي رقابتي عبارتند از:

الف) روش رقابتي يا مهاري براي آنتي‏ ژن:

اساس اين روش بر رقابت بين آنتي ‏ژن نشاندار و آنتي‏ ژن موجود در نمونه براي اتصال به يك آنتي ‏بادي اختصاصي كوت شده در چاهك استوار است. در اين روش مقدار آنتي‏ بادي كوت شده بايد محدود باشد و ملكول سيگنال دهنده همان آنتي ‏ژن نشاندار است، اساس RIA و EIA كلاسيك به همين روش استوار است. در اين روش منحني پاسخ - دوز به صورت معكوس خواهد بود، بدين معني كه آناليت نشاندار در حضور مقادير زيادي از آناليت غيرنشاندار موجود در نمونه به مقدار كمتري به آنتي‏ بادي متصل مي‏شود و در نتيجه سيگنال هم بوجود خواهد آمد. محدوده تعيين آناليت با اين روش ممكن است بوسيله استفاده از مولكول نشاندار با فعاليت اختصاصي زياد تقويت شود اما حداقل مقدار قابل تشخيص (كمترين مقدار از آناليت كه قابل تشخيص خواهد بود) توسط تمايل آنتي‏ بادي مورد استفاده تعيين مي‏شود، با اين وجود غلظتهاي خيلي كم از هاپتن‏ها عموما توسط همين روش قابل تعيين‏اند و حساس ‏ترين روشي است كه مي‏تواند مقدار كمتر fmol را هم تشخيص دهد. در برخي از موارد نشاندار كردن روي خصوصيات هاپتن اثر مي‏گذارد در نتيجه در روش رقابتي براي تعيين آنتي‏ژن از يك آنتي ‏بادي نشاندار استفاد مي‏شود، در اين نوع از سنجشها اين مطلب ضروري است كه فاز جامد توسط آنتي ‏ژن با مقدار كم و ثابت پوشيده مي‏شود، در اين روش آناليت موجود در نمونه با آناليت كوت شده در چاهك براي اتصال به آنتي ‏بادي نشاندار رقابت مي‏كند. در اينجا هم منحني استاندار معكوس است، از اين روش بيشتر براي سنجش به روش كمي لومينسانس استفاده مي‏شود.

ب) روش رقابتي براي آنتي‏ بادي:

دراين روش رقابت بين دو آنتي‏ بادي يكي در نمونه به صورت غيرنشاندار و يكي به صورت نشاندار شده با آنزيم برای اتصال به يك آنتي ‏ژن كوت شده در چاهك صورت مي ‏پذيرد، بديهي است كه هر چه مقدار آنتي‏ بادي نمونه بيشتر باشد آنتی‏ بادی نشاندار كمتري به چاهكها متصل شده و سيگنال نيز كمتر خواهد بود و در نتيجه منحني استاندارد نيز معكوس مي‏باشد. شاخص‏ترين مثال اين روش اندازه‏ گيري آنتی‏ بادی ضد HBc است.