به این ترتیب که چاهک ها آنتی بادی مونو کلونال که بر علیه  T4 می باشند پوشانده شده اند و در هنگام انجام آزمایش هورمون  T4  به همراه  T4  کونژوگه شده با آنزیم HRP  و سرم به چاهک ها اضافه می شوند. در این هنگام پروتئین های حامل هورمونهای تیروئیدی بر حسب ظرفیت آنها مقداری از هورمون  T4 را جذب می نمایند ولی نمی توانند با هورمون  T4  کونژوگه واکنشی نشان دهند در نتیجه مقداری از  T4  که جذب پروتئین های حامل نگردیده است بر سر اتصال به آنتی بادی های کف چاهک با هورمون  T4  کونژوگه رقابت می نماید. بنابراین هر چه ظرفیت حمل پروتئین های سرم بالاتر باشد مقدار  T4  کمتری برای رقابت با  T4 کونژوگه باقی مانده و در رقابت با آن  در اتصال به آنتی بادی های کف چاهک ناموفق تر خواهد بود. پس از شستشو محلول سوبسترا به چاهک ها اضافه می گردد که هر چه میزان رنگ زایی بیشتر باشد بیانگر بالاتر بودن میزان اتصال  هورمون  T4  کونژوگه بوده و آن خود به این معنی است که مقدار  T4 برداشت شده توسط پروتئین های حامل بالاتر بوده،  بنابراین مقدار کمتری  T4  در سرم باقی مانده و نسبت اتصال آنها به آنتی بادی های کف چاهک کمتر بوده است و بالعکس. برای جلوگیری از فعالیت بیش از اندازه و نامناسب آنزیم، محلول متوقف کننده اضافه می گردد که فعالیت آنزیم را مختل کرده و رنگ آبی را به زرد تبدیل می نماید که بهترین جذب نوری را در طول موج 450 نانو متر دارد.